多肽合成的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。到現(xiàn)在，人們已在人體中發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種肽類，關(guān)于多肽的研究與應(yīng)用，也取得了巨大的進(jìn)步，引發(fā)了空前的研究熱潮。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值，多肽研究成為了醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)對(duì)象，世界各先進(jìn)國家無不撥出巨款來建立各種規(guī)模的多肽研究中心，以期在這一重要領(lǐng)域中取得突破性進(jìn)展。現(xiàn)在具有生物活性的多肽已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在臨床檢測(cè)、醫(yī)學(xué)研究、疾病防治和治療等三大方面。

1，多肽合成的研究歷史

多肽合成研究已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識(shí)太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基（Z）來保護(hù)α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到了20世紀(jì)50年代，有機(jī)化學(xué)家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素，胰島素等，同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法（SPPS），這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出現(xiàn)就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)砹硕嚯挠袡C(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科——固相有機(jī)合成（SPOS），為此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Merrifield經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基（BOC）用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時(shí)，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶（124個(gè)氨基酸）。1972，Lou Carpino 首先將9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動(dòng)合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時(shí)，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護(hù)基，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。

2，多肽合成的原理與步驟

多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。

2.1多肽合成基本原理：
先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護(hù)基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為FMOC固相合成法。

2.2固相多肽合成的步驟：
A，樹脂的選擇及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的載體主要有3類：交聯(lián)聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂類樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護(hù)的氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵來實(shí)現(xiàn)。
B，氨基、羧基、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù)，同時(shí)對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的活性基團(tuán)也要保護(hù)，反應(yīng)完成后再將保護(hù)基團(tuán)除去，近年來，F(xiàn)MOC合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù)。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法。
C，成肽反應(yīng)
固相中的成肽反應(yīng)一般是將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的縮合劑(如碳二亞氨)形成對(duì)稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。
D，裂解及合成肽鏈的純化
BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時(shí)根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。 

3，固相多肽合成的應(yīng)用——多肽合成儀

多肽固相合成技術(shù)的發(fā)明同時(shí)促進(jìn)了多肽合成的自動(dòng)化。世界上第一臺(tái)真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期，它是利用氮?dú)夤呐輥韺?duì)反應(yīng)物進(jìn)行攪拌，用計(jì)算機(jī)程序控制來實(shí)現(xiàn)有限度的自動(dòng)合成。雖然在各項(xiàng)功能方面有著明顯的缺陷，但是它畢竟把人從實(shí)驗(yàn)室里解放出來，極大地提高了工作效率。
隨著多肽科學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家也對(duì)合成儀提出了更高的要求，從而帶動(dòng)了合成儀的發(fā)展。目前多肽合成儀品種繁多。從合成量上分，可分為微克級(jí)的，毫克級(jí)的，克級(jí)的和公斤級(jí)的；從功能上分，可分為研究型的，小試型的，中試型的，普通生產(chǎn)型的和GMP生產(chǎn)型的；從自動(dòng)化程度上分，可分為全自動(dòng)的，半自動(dòng)的和手動(dòng)的；從通道上分，可分為單通道的和多通道的；從技術(shù)角度上分，可分為第一代的，第二代的，和第三代的；等等。
第一代多肽合成儀標(biāo)志性特點(diǎn)是采用氮?dú)夤呐莸臄嚢柙韥韺?duì)反應(yīng)物進(jìn)行攪拌，即合成儀上反應(yīng)器是固定的，氮?dú)鈴姆磻?yīng)器的下方通過反應(yīng)器到上部排出，在這一過程中產(chǎn)生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設(shè)計(jì)的好處是結(jié)構(gòu)簡單，成本低，但各項(xiàng)功能方面有著明顯的缺陷，目前采用氮?dú)夤呐莘绞降牡谝淮嚯暮铣蓛x已大部分退出了市場(chǎng)。

第二代多肽合成儀標(biāo)志性特點(diǎn)是用不完全性的機(jī)械攪拌來取代氮?dú)夤呐荩话憧煞譃榻佑|式攪拌與非接觸式攪拌兩種。
接觸式攪拌常見的攪拌方式是伸入反應(yīng)器內(nèi)部的螺旋槳由上部的電機(jī)帶動(dòng)進(jìn)行快速旋轉(zhuǎn)，使反應(yīng)器內(nèi)部的固液兩相進(jìn)行混合。但攪拌方式帶來的不利因素如清洗障礙，合成量低，反應(yīng)死角等也不容忽視，目前全世界共大多數(shù)多肽合成儀生產(chǎn)廠商放棄了接觸式攪拌方法。
機(jī)械性非接觸式攪拌的主要原理是反應(yīng)器在直立下圍繞原點(diǎn)作左右擺動(dòng)，或者圓周運(yùn)動(dòng)。這種由反應(yīng)器本身的運(yùn)動(dòng)而帶動(dòng)里面固液兩相混合的方法克服了接觸式攪拌帶來的缺點(diǎn)，合成產(chǎn)量和純度也明顯好于用氮?dú)夤呐莸牡谝淮铣蓛x。所以機(jī)械性非接觸式攪拌成為了多肽合成儀的主流。但是由于這種攪拌方法不能真正消除反應(yīng)死角，所以科學(xué)家們并沒有滿足而停下他們追求完美的腳步。
 
第三代多肽合成儀其反應(yīng)器轉(zhuǎn)動(dòng)方式有別于前兩代的多肽合成儀，即反應(yīng)器上方相對(duì)固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動(dòng)反應(yīng)器里的固液兩相從底部向上作螺旋運(yùn)動(dòng)，一直達(dá)到反應(yīng)器的最上方，真正做到了無死角。無死角多肽合成儀的另一種方式是反應(yīng)器在數(shù)控馬達(dá)的帶動(dòng)下作上下180度的翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。固相和液相在運(yùn)動(dòng)過程中不斷從反應(yīng)器的一端到達(dá)另一端再返回來。一般用這種儀器合成出來的肽純度是最高的，且適合于擴(kuò)大生產(chǎn)。
 
隨著多肽藥物科研和生產(chǎn)的不斷升溫，市場(chǎng)對(duì)儀器的需求還會(huì)持續(xù)增長，現(xiàn)在全世界已有十幾家公司專門從事多肽合成的研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。其中，多肽合成儀的商業(yè)化開發(fā)相對(duì)成熟，美國的CEM公司是世界上非常有影響的多肽合成儀提供商，它開發(fā)的Liberty研究級(jí)微波多肽合成儀，能一次性合成長達(dá)111個(gè)氨基酸的多肽，創(chuàng)造單次合成多肽的最長記錄，是目前市場(chǎng)占有率增長速度最快的研究級(jí)全自動(dòng)多肽合成儀，并被美國Brookhaven國家實(shí)驗(yàn)室以及安進(jìn)公司應(yīng)用于SARS和艾滋病的藥物研究。此外，美國的PTI公司已經(jīng)發(fā)展成為集多肽合成儀制造、多肽合成試劑生產(chǎn)、以及其它相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)及技術(shù)支持的大公司，其產(chǎn)品線囊括了多通道，生產(chǎn)型等各個(gè)層次滿足科研用戶及企業(yè)的需求；美國PSI公司首次研制出世界上第一臺(tái)擁有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、完全符合美國FDA認(rèn)證要求的大規(guī)模全自動(dòng)多肽合成儀，建立了在本領(lǐng)域內(nèi)的領(lǐng)先地位，PSI的6大系列多肽合成儀能全面滿足各類用戶的多種需求，并可根據(jù)客戶需求量身訂制合成儀；美國ABI公司前兩年推出的433系列全自動(dòng)多肽合成儀，為學(xué)者和機(jī)構(gòu)提供了針對(duì)的服務(wù)良好的技術(shù)支持；美國CS Bio公司開發(fā)了各種規(guī)模的全系列多肽合成儀，經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，已經(jīng)成為全球性多肽合成儀生產(chǎn)商，公司產(chǎn)品遍布全球，由于其優(yōu)良的產(chǎn)品性能和良好的用戶口碑，CS Bio合成儀在中國的市場(chǎng)份額相當(dāng)可觀；美國AAPPTEC公司成立于2005年3月，公司的前身是ACT（Advanced ChemTech）公司的儀器部，近年來，AAPPTEC公司在全自動(dòng)多肽合成儀領(lǐng)域，針對(duì)不同的需求研發(fā)出數(shù)十種類型的儀器，加上長期實(shí)際應(yīng)用驗(yàn)證的可靠性，這些儀器均可滿足不同客戶的不同需求，而且使用起來都相當(dāng)便利。
 
4，固相多肽合成的前景
 
固相多肽合成已經(jīng)有近50年的歷史了，其技術(shù)亦比較成熟,多肽合成技術(shù)不斷完善,從小規(guī)模、短肽鏈合成發(fā)展到大規(guī)模、長肽鏈的合成。化學(xué)多肽制備蛋白質(zhì)與從純化蛋白質(zhì)開始制備抗體比較，不僅省時(shí)省事省錢，而且特異性高。通常從蛋白質(zhì)序列中選擇、合成多肽到制備出抗體，只需2-3個(gè)月，而從基因表達(dá)、蛋白質(zhì)純化到抗體產(chǎn)生至少需要2-3年，而且蛋白質(zhì)家族成員和種間的特異性不能保證。例如，2003 年上市的抗愛滋病藥物T-20就是一個(gè)全合成的36個(gè)氨基酸殘基組成的小肽藥物。上世紀(jì)90年代,組合化學(xué)與多肽合成技術(shù)相結(jié)合后,又出現(xiàn)了組合肽庫的合成,對(duì)化學(xué)、生化、醫(yī)藥、分子生物學(xué)等領(lǐng)域起到了巨大的推動(dòng)作用，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，在多肽研究發(fā)展過程中,對(duì)保護(hù)氨基酸的要求也不斷提高,使之不斷改進(jìn)，對(duì)于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成方法，而更多的集中在多肽標(biāo)記與修飾方法，以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的合成以及長肽或蛋白合成。至今，人們的要求已經(jīng)從合成一些較短的肽鏈，延伸到了能否利用從生物體合蛋白質(zhì)的原理，研究合成出人們理想的任意肽段，這也是今后多肽合成的發(fā)展趨勢(shì)。