色国产精品女五丁香五月五月_99tv成人_性色a∨精品高清在线观看_国产精品一级黄片免费在线观看_亚洲天堂高清_日本高清一道本

今天是:2023年08月28日
首頁   >   技術文章   >   蛋白質磷酸化Western Blot修飾研究的新方法

蛋白質磷酸化Western Blot修飾研究的新方法
Introduction
        蛋白質磷酸化對于許多生物現象的引發是很必要的,包括細胞生長、增殖、泛素(ubiquitin)介導的蛋白降解等過程。特別是酪氨酸磷酸化,作為細胞信號轉導和酶活性調控的一種主要方式,通常通過引發蛋白質之間的相互作用,進而介導生長因子、荷爾蒙和細胞因子等對細胞膜上受體的信號調控。
        然而,酪氨酸磷酸化在細胞的所有磷酸化修飾中所占的比例卻非常低。大概10%的細胞蛋白會受到磷酸化共價修飾,但每100次蛋白的磷酸化修飾中僅有1次酪氨酸基團的修飾。與大部分細胞中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化水平相比,酪氨酸磷酸化的水平估計要低2000倍。正是由于細胞中酪氨酸磷酸化的水平相當低,才能保證細胞在內外信號的刺激下,作出靈敏的反應,所以研究酪氨酸的磷酸化對于細胞信號的調控和許多重要生物現象的研究具有極為重要的意義,而對發生酪氨酸磷酸化的蛋白質的識別及磷酸化位點的鑒定對揭示細胞過程的調控和藥物的作用位點起到非常重要的作用。研究蛋白質磷酸化的相關方法:
磷酸化Western Blot
        對于信號轉導科研來說,抗酪氨酸磷酸化抗體的出現是一個意義重大的事件。在沒有抗酪氨酸磷酸化抗體之前,蛋白質和酶的酪氨酸磷酸化只能通過非常危險的并且很費時的放射性實驗來檢測。而利用抗酪氨酸磷酸化抗體,則可以通過Western Blot或其它免疫學方法輕松地檢測到磷酸化信號。常規的檢測方法包括:用抗酪氨酸磷酸化抗體在Western Blot上檢測內源或外源表達的磷酸化蛋白。如果目標蛋白的含量較低,也可利用免疫沉淀的方法先富集發生磷酸化的酪氨酸蛋白,再檢測目標蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗體也常用于檢測在不同處理的條件下,細胞內總的酪氨酸磷酸化水平的變化情況,作為許多細胞生物現象的一個重要指標。
       我們都知道如果需要檢測某一個目標蛋白的某一特定位點的磷酸化狀態,可以選用該蛋白特定位點的磷酸化特異性抗體。但由于我們研究的通常是新的磷酸化位點,或者這些蛋白特定位點的磷酸化抗體效果不夠好,我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家自己制備過磷酸化抗體,就會知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的制備更加困難,而且浪費大量寶貴時間。現在國外的科學家發現可以使用通用型的磷酸化抗體,只要巧妙的設計實驗,也可以達到同樣的檢測目的。以Yuan的文章為例,他們需要檢測BCR-ABL的磷酸化,但他們沒有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠子來免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白,然后再通過Western-Blot4G10通用型酪氨酸磷酸化抗體(pan-phosphotyrosine)來鑒定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一組以Clemens為首的科學家,則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了DACK蛋白,再用4G10酪氨酸磷酸化抗體來檢測DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平,通過區分這些蛋白的分子量大小,來確認相應的磷酸化條帶的蛋白身份。
        與做普通的Western Blot相比,磷酸化Western Blot有一些要額外需要注意的事項:
        首先,由于蛋白的磷酸化是可逆的,會被磷酸酶去磷酸化,所以在樣品制備和整個免疫檢測過程中,需要抑制或避免細胞內源性和外源性的磷酸酶的干擾。針對細胞內源性的磷酸酶,我們在樣品制備時,需要在細胞裂解液中加入足量的并且是新鮮的磷酸酶抑制劑,如PhosphoSafe 系列。外源性的磷酸酶主要是由實驗過程中的其它試劑帶入的,比如我們要確保封閉劑中不含磷酸酶等。同時,樣品中或其它試劑中帶的細菌也會分泌外源性的磷酸酶,所以做磷酸化Western Blot的另一個關鍵是要盡量使用清潔的新鮮的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝膠,并且最好在樣品制備完就立刻上樣,當天完成SDS-PAGEWestern Blot 檢測。如果要使用同一塊Blot進行全蛋白的免疫檢測,就需要先做磷酸化的檢測再做全蛋白的檢測,以盡量避免磷酸化信號的丟失,這點非常重要。
        有一些實驗是用Western Blot來驗證一組磷酸化的多肽或蛋白的存在,這時候就需要使用的通用型磷酸化抗體。因為通用型磷酸化抗體,如4G10酪氨酸磷酸化抗體,具有廣泛的識別范圍,同時具有很好的磷酸化特異性,才不會導致假陰性結果的產生。
        Liu的研究為例,他們就使用了通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10PY20,利用Western Blot技術來驗證其通過多肽芯片篩選出的多肽結果。他們的實驗室是這樣設計的,首先利用磷酸化酪氨酸的多肽芯片(phospho-tyrosine peptide array)來篩選與SH2結構域結合的磷酸化多肽序列,然后對這些合成的多肽序列進行Western Blot驗證,利用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體4G10PY20檢測其磷酸化水平。他們發現不同的抗體具有很不一樣的識別特異性,如pTyr-Pro 序列能被某些SH2結構域結合,而不被4G10PY20識別。但就總體而言,通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體可以識別絕大多數的SH2結構域結合的磷酸化多肽,特別是4G10抗體比PY20抗體能識別更多的磷酸化酪氨酸多肽。
\
磷酸化蛋白質組學(PhosphoProteomics):
       
磷酸化蛋白質組學與蛋白質組學類似,可以通過2D膠和質譜MS鑒定出新的磷酸化蛋白和蛋白的新磷酸化位點。但是利用MS從磷酸化蛋白中檢測出磷酸化肽段會遇到許多問題,這是由于樣品中大量的非磷酸化肽段的存在使磷酸化肽段的相對濃度降低造成的。大量的非磷酸化肽段會抑制MS對磷酸化肽段的檢測,因此必須采取額外的實驗步驟在MS之前富集磷酸化蛋白或磷酸化肽段。對此,抗磷酸化特異性抗體以及親和層析瓊脂糖珠子或柱子就能起到很好得到富集作用。特別是對于細胞中比例很低的酪氨酸磷酸化的研究來說,富集的過程尤顯重要。目前,通用型的抗酪氨酸磷酸化(pan-phosphotyrosine)單克隆抗體4G10PY20已被證明對尋找蛋白酪氨酸磷酸化位點起到很好的作用。除此以外,也有一些通用型的抗絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的抗體如4A4,也可用于MS之前富集絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的蛋白。
        Guha研究組就是利用這種方法來研究EGFRKRAS的磷酸化水平變化的。
       在肺腺癌(lung adenocarcinoma)病人中,原癌基因EGFRKRAS是兩個最經常發生突變的基因。但是帶有EGFR不同的突變或帶有KRAS的突變的病人,對TKI治療法(酪氨酸激酶抑制劑治療法)有不同的治療效果。Guha等人通過磷酸化蛋白質組學的方法來比較帶這些不同突變的病人的磷酸化蛋白的情況,揭示這些突變的細胞內EGFRKRAS的下游信號通路的變化,從而揭示了解造成TKI治療不敏感的機理。
        首先,Guha等人使用了偶聯了抗酪氨酸磷酸化抗體的瓊脂糖珠子(4G10-agarose),對帶有不同突變的細胞裂解液進行免疫沉淀。通過這一步,可以對發生酪氨酸磷酸化的蛋白以及與這些磷酸化蛋白緊密結合的其它蛋白進行有效的富集。免疫沉淀的蛋白可以被100mM的磷酸苯酯洗脫出來,然后進行透析,為下一步跑膠做去除過多的鹽分和離子的準備。其實,透析很費時間,而且蛋白樣品甚至會被稀釋,可以選擇使用超濾離心(Amicon Ultra)的方法用半小時就可去除離子同時濃縮樣品。接下來,處理好的磷酸化蛋白樣品通過SDS-PAGE 膠分開后,進行質譜分析前的常規處理,包括使用Coomassie 染料進行染色,把膠切成20-30塊小塊,胰酶消化成多肽片段等。通過LC-MS\MS,即可定性和定量的分析發生酪氨酸磷酸化的蛋白以及與這些磷酸化蛋白緊密結合的其它蛋白。已被鑒別出的這些蛋白,可以用Western blot的方法,并結合使用特異性蛋白抗體和4G10抗體,對這些蛋白的酪氨酸磷酸化狀態進行進一步確認。
        Lind等人的研究也利用了類似的方法,在做質譜分析之前,使用通用型的抗酪氨酸磷酸化抗體來富集磷酸化蛋白或肽段。有趣的是,他們與前面提到的Liu的文章有一致的發現,在文中使用的5種酪氨酸磷酸化抗體中,使用4G10抗體富集的MS結果最后識別了最多的潛在酪氨酸磷酸化蛋白。
        除了這種磷酸化蛋白質組學的通用方法以外,現在也出現了創新的方法來幫助研究磷酸化蛋白質組學。其中基于Luminex xMAPEpitomeEpiquant技術,就實現了對多種蛋白的磷酸化和同一蛋白上的多個磷酸化位點以及全蛋白,同時進行高通量地定量檢測。考慮到同時檢測同一個細胞上,同一條Pathway上、下游蛋白的協同作用,可使用流式細胞術進行研究。
蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性分析:
        酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶(PTK)誘導。PTK有很多的種類,包括跨膜的和細胞質內可溶性的酶。PTK在多種細胞過程中發揮了極其重要的作用,其中包括細胞生長、分化和新陳代謝等。許多疾病也與某些PTK失調密切相關,比如造血系統的惡性腫瘤、腎細胞癌、甲狀腺癌等多種癌癥以及糖尿病、類風濕性關節炎等等。因此,對于PTK的活性分析也是細胞調控研究和藥物研發中常常需要進行的研究。通過PTK的活性分析可以篩選PTK抑制劑,并可以獲得這些抑制劑的IC50參數。
        PTK的活性分析最傳統的方法就是使用同位素的PTK的活性分析,后來也有多種非放射性的較安全的分析方法,例如,有基于ELISAPTK活性分析,其中應用了可以被許多PTK磷酸化的隨機多肽序列和HRP偶聯的抗酪氨酸磷酸化的特異性抗體。也有基于競爭性結合的熒光偏振的分析方法。現在,更有基于HTRF (homogenous time-resolved fluorescence) 的全新的PTK活性分析方法。這種方法利用了熒光共振能量轉移(FRET)的原理,比基于ELISA和基于熒光偏振的方法更靈敏,信號也更穩定,對于需要一段時間孵育的激酶分析來說會更有優勢。以通用型的4G10 HTRF分析為例,它使用了偶聯于Europium的工業化標準單克隆抗體4G10,生物素標記的酪氨酸多肽底物,和APC標記的鏈霉素等。只要在體系中加入PTK激酶后,若多肽底物發生磷酸化,則此底物能被4G10抗體結合,導致熒光染料APCEuropium的距離很近足以發生熒光共振能量轉移,激酶的活性越強則HTRF信號的加強越顯著(實驗原理見下圖)

\
 
創博環球(北京)生物科技有限公司
電話:010-63836252
傳真:010-63836252
郵箱:info@globalebio.com
 

主站蜘蛛池模板: 成人区一区二区三区_精品毛片_亚洲免费毛片基地_国产精品222_秋霞午夜无码鲁丝片午夜精品_性深夜免费福利视频_嫩草tv_免费高清特黄a大片 | 免费日韩在线视频_99久久精品免费精品国产_日韩亚洲一区在线_偷拍东北熟女BBWW_国内外免费激情视频_久久久伦理片_亚洲欧美日本国产不卡_欧美一区二区一级片 | 在线观看免费视频18_亚洲日韩欧美在线观看_www视频在线观看_欧美一区二区三区成人久久片_99久久一区_黄色在线_999国产在线_97精产国品一二三产区 | 亚洲成年人av_日本高清不卡一区二区三区视频_羞羞答答xxdd在线播放_97国产_日本十八禁免费看污网站_天天综合网久久_美女18禁裸乳裸体无遮挡的网站_伊人久久精品一区二区三区 | 一区视频免费在线观看_69pao视频_中国产xxxxa片在线观看_一本大道久久精品懂色aⅴ_亚洲欧洲成人精品AV97_黄色一级免费网站_亚洲成人福利在线观看_色宅男看片午夜大片啪啪 | 精品国产一区二区三区久久_国产乱人伦真实精品视频_欧美肥胖老太bbw_一区二区三区在线视频_精品嫩草_欧美性xxxx视频_曰本黄色片_性XXXX中国HD | 亚洲m码欧洲s码sss222_午夜伦4480yy私人影院免费_成人一区二区在线观看_国内精品免费一区二区三区_久草91视频_91视频导航_蜜臀av免费_玖玖国产 | 水蜜桃AV无码_看黄网站在线看_国产黄在线看_国产日产免费高清欧美一区_青青草综合视频_免费久久久久_精品91久久久_久久国产精品无码网站 | 天堂蜜桃一区二区三区_日韩免费一级片_黄色国产一级_校园春色在线观看_亚洲精品无码一区二区三区在线高_年轻的朋友6韩剧免费_伊人干综合_99久久九九 | 国产成人无码精品久久久免费_国产xxxx_欧美成人免费_97超碰97_色欲蜜桃AV无码中文字幕_老司机精品在线_九色视屏_av片免费看 | 日本亚洲a_丰满人妻久久中文字幕免费_国产午夜大片_一级黄色日本_国产精品美女久久久m_亚洲视频网站在线观看_男女多P混交群体交乱A片_四虎最新影院 | 亚洲一区二区三区自拍公司_久久久久亚洲AV片无码V_久久久国产打桩机_强奷表妺好紧2_好吊色成人在线视频_靠比视频在线免费观看_国产一级视频免费观看_亚洲第一激情 | 麻豆国产精品色欲av亚洲三区_午夜少妇在线观看视频_欧美亚洲第一页_久久小草_国产高清视频色欲_亚洲av无码成h人动漫无遮挡不卡_在线亚洲一区二区_美女被强遭的免费网站视频 | 黄色成年网站_亚洲午夜无码AV毛片久久_sss海量视频在线观看_日韩精品卡1卡二卡3卡四卡_se亚洲_日本添下边无码视频全过程_性爱在线免费视频_亚洲熟妇无码AV不卡在线 | 曰曰摸天天添天天湿_欧美日韩国产限制_av中文字幕一区_国产传媒av在线_亚洲一区二区三区四区av_国产精品露脸国语对白_久久无码中文字幕东京热_欧美野战 | 女人一级一片30分_亚洲综合图_永久免费不卡的AV网站_女人下边被添全过程A片_无码中文精品专区一区二区_日本大胆欧美_aaa大片在线观看_999一区二区三区 | 亚洲乱亚洲乱妇无码_午夜dj高清www免费视频_久久久久国产A免费观看RELA_国产在线一二区_特黄免费av_AV不卡在线永久免费观看_日本熟妇洗澡videos_与子乱对白在线播放单亲国产 | 人人爽人人澡人人人妻_亚洲夜色av_日韩最新免费无码视频_久久精品日韩按摩中文字幕_亚洲午夜福利717_国产成人亚洲日韩欧美久久久_15GAY男同志同性1069_www.色网 | 国产欧洲精品色在线_2018天天干夜夜操_亚洲色无色A片一区二区_女性裸体无遮挡无遮掩视频蜜芽_最近免费中文字幕在线mv视频8_欧美国产日本高清不卡_日本一卡二卡3卡四卡网站精品_99久e精品热线免费 | 天天操天天插天天干_91一级毛片_无码亲近乱子伦免费视频在线观看_69vd视频_国产高清激情在线观看_欧美性受xxxx_色欧美色美色一区二区在线_99看片 | 人妻系列综合第一页_中文91_性欧美人与zozoxxxx视频_国产女人18毛片水真多1_成人av1234567_别揉我奶头~嗯~啊~一区二区三区_在线播放一区二区三区_96精品成人无码A片观看金桔 任你操精品视频_老子影院午夜伦不卡_精品日产一区二区三区手机_最大av在线_VPS私人毛片免费_四十路の五十路熟女豊満_中国人与拘一级毛片_h视频免费 | 天天夜夜骑_亚洲国产五月综合网_亚洲v区_午夜久久久精品_日本一区二_亚洲欧美日韩Aⅴ在线观看_国产成人精品一区一区一区_北条麻妃在线一区二区 | 高级毛片_521av永久免费网_日韩国产欧美亚洲v片_欧美xxxav_麻豆精品A片免费观看_一级毛片免费毛片一级毛片免费_女人18毛片水最多_青草久久精品 | 亚色网址_亚洲第一综合区_久久99精品久久久_污污内射在线观看一区二区少妇_夜草av_免费无码一区二区三区蜜桃大_激情av无码后入_77色77国产欧美在线 | 国产精品成人av_777亚洲熟妇自拍无码区_精品成人一区二区_成年片黄色日本大片网站视频_国产精品一区二区在线_亚洲青涩网_国产无遮挡裸露视频免费_中国毛片一级片 | 一本三级_欧美乱码一区二区三区_少妇又色又爽又高潮_免费黄在线观看_四虎精品一区_日本在线观看不卡_久久综合成人网_久草网免费 | 午夜高清福利_亚洲精品欧洲_就爱干av_国产片在线免费观看_视频黄色免费_好男人社区WWW在线观看_日日噜噜夜夜狠狠视频_亚洲中文成人中文字幕 | 成人毛片视频在线观看_国产精品自在在线免费_快播看片毛网站_亚洲成a人片777777久久_人与人一级毛片_日本波多野结衣在线_超碰人人擦_日韩欧美久久久久久久999按摩 | 久久久999_国产精品6666_韩日av一区二区三区_18成人片黄网站WWW_国产精品偷伦在线观看_97人人做人人人难人人做_色777狠狠狠综合_国产色亚洲 | 東热精品中字久久无码五月天_大地资源在线观看免费高清一_国产69精品久久久久9999人_日本中文字幕视频在线观看_yy6969久久亚洲精品_一级做a爰片久久毛片一_91在线观看视频_www.中出 | 91区在线观看_国产精品91久久久久久_国产精品久久久久四虎_国语自产自拍_亚洲aⅴ久久精品蜜桃小仓由菜_91靠逼软件_动漫精品视频一区二区三区_国产区视频在线播放 | videos另类灌满极品另类_久久综合九色综合97伊人_天天看片夜夜爽_国产精品国产精品国产_福利片第一页_国产真实露脸乱子伦_久久精品人人_特级全黄男女交高清视频在线观看 | 人妻系列综合第一页_中文91_性欧美人与zozoxxxx视频_国产女人18毛片水真多1_成人av1234567_别揉我奶头~嗯~啊~一区二区三区_在线播放一区二区三区_96精品成人无码A片观看金桔 任你操精品视频_老子影院午夜伦不卡_精品日产一区二区三区手机_最大av在线_VPS私人毛片免费_四十路の五十路熟女豊満_中国人与拘一级毛片_h视频免费 | 国产免费观看久久_91最新在线视频_曰韩免费视频_女人高潮一级一片_边摸边吃奶边做爽gif动态视频_久色国产在线_伊人网视频在线观看_午夜福利啪啪片 | 久久丫忘忧草产品_在线成人一区_精品久久久久久久久久_亚洲精品午夜_91骚片_最近2019中文字幕第二页_91视频麻豆_国产精品女A片爽爽波多野结衣 | 日韩一级大片_久久久久区_黄色大片一级片_国产成年无码V片在线_一级黄色伦理片_毛片女女女女女女女女女_成人免费在线_无码精品人妻一区二区三区九里奈 | 亚洲AV无码一区二区三区观看_视频成人免费_亚洲欧美精_国产精品喷水_亚洲永久网站_日本公妇被公侵犯中文字幕2_日韩中文字幕2019_成人欧美视频在线观看 | 国产国语性生话播放_国一级片_成人拍拍视频_色婷婷综合久久久久中文图片_av在线亚洲男人的天堂_在线观看麻豆国产成人AV在线播放_女人一级片_一区一区视频 www视频在线观看免费_五月天狠狠干_精精国产视频_黄色一二三区_精品视频国产_操人网址_成年人视频在线免费看_狠狠操操 | 一夜新娘第三季高清免费观看_国产精品久久呻吟_91精品国产亚一区二区三区老牛_av色天天_1024在线观看国产天堂_国产一区二区在线观看视频_欧美精品成人在线_中文在线8资源库 | eeuss秋霞午夜免费影院四平_天天爱天天操天天干_少妇高潮久久久久久潘金莲_福利一区二区_国产成在线观看免费视频成本人_成人毛片a_999久久精品_国产男女猛烈无遮挡免费视频 | 中文字幕人妻三级中文无码视频_少妇9999九九九九在线观看_公和我在野外做好爽爱爱小说雨婷_无码H黄肉3D动漫在线观看_亚洲视频二区_日本又色又爽又黄的视频免_国产精品国产精品不卡_亚洲一区中文字幕在线观看 |